Sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng
Phương pháp tách
Các cấu tử được tách phân bố giữa
pha tĩnh và pha động
Mobile phase (Pha động)
Stationary phase (Pha tĩnh)
1. Khái niệm về kỹ thuật sắc ký lỏng
Quá trình tách dựa vào tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất.
Dựa trên 2 quá trình:
Hấp phụ
Giải hấp phụ
Xảy ra liên tục giữa 2 pha:
Pha tĩnh: chất rắn hoặc lỏng
Pha động: chất lỏng (1 chất hoặc hỗn hợp nhiều chất)

Pha động: hòa tan và di chuyển chất phân tích
Pha tĩnh: giữ chất phân tích
SKL chia thành 2 nhóm
SK lỏng áp suất thường (sắc ký cổ điển)
SK lỏng áp suất cao (SKL hiệu năng cao: HPLC)
(High Performance Liquid Chromatography)
Dựa vào bản chất của quá trình sắc ký, HPLC:
- SK phân bố
- SK pha thường (normal phase chromatography
- SK pha đảo (reversed phase chromatography)
- Sk trao đổi ion (ion exchange chromatography)
- SK ghép cặp ion (ion pair chromatography)
Pha động: Lỏng
Pha tĩnh: Lỏng


Pha động: lỏng
Pha tĩnh: Rắn
SK lỏng – lỏng (LLC)
(Liquid – liquid chromatography)
SK lỏng – rắn (LSC)
(Liquid – solid chromatography)
- Dựa vào trạng thái pha tĩnh
Khi nối với đầu do (detector), HPLC cho phép:
Định tính: dựa vào thời gian lưu
Định lượng: dựa vào chiều cao hoặc diện tích peak
2. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC



0: Nguồn cung cấp pha động (mobile phase)
- Bình chứa pha động
1
2
3
4
5
0
1: Bơm cao áp (hệ thống cung cấp dung môi)
Bơm pha động vào cột tách
Điểu khiển tốc độ dòng, áp suất của pha động
2. Van bơm mẫu (Injection valve):
Bơm mẫu PT vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định
Tiêm mẫu bằng tay
Tiêm mẫu tự động (Auto sampler)
3: Cột tách (Column)
Cột chứa pha tĩnh
Yếu tố quyết định quá trình tách sắc ký
Cột tách có kích cỡ khác nhau
Chiều dài: 10 – 25cm
Đường kính: 2 – 5mm
4: Đầu dò (detector)
Thiết bị phát hiện chất phân tích (định tính và định lượng)
Có nhiều loại khác nhau tùy mục đích phân tích: UV-VIS, Huyønh Quang, Ñoä Daãn, Ñieän Hoùa, Khoái Phoå,…
5. Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu:
Thu thập và xử lý kết quả
Recorder, Computer + printer, software
Start
Injector
Detector
Column
Mobile phase
Hệ thống HPLC đơn giản
Detector
♣ UV-Vis: detector phổ hấp thu phân tử
Xáv định các chất có khả năng hấp thu quang
♣ Huỳnh quang (Fluorescence detector): xác định các chất có khả năng phát huỳnh quang
- Alflatoxin, Mycotoxin, Amino Acid, thuốc trừ sâu họ Carbamate,….
♣ Đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector: RI)


♣ Đầu dò độ dẫn (Conductivity detector):
Xác định các ion vô cơ, hữu cơ
♣ Đầu dò khối phổ (MS: mass spectrometry)
Xác định phần lớn các chất hữu cơ
3. Các quá trình tách trong sắc ký lỏng
Quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký
Những cân bằng động xảy ra giữa pha tĩnh và pha động trong cột sắc ký
Là sự vận chuyển và phân bố liên tục của chất PT từ đầu cột đến cuối cột
Chất phân tích luôn phân bố giữa 2 pha, trong đó pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định hoặc gradient
Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động
Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp

Thời gian chất PT bị pha tĩnh lưu giữ (thời gian lưu) quyết định bởi:
Bản chất của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của chất PT
Bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất PT ra khỏi cột sắc ký (pha tĩnh)
Ghi lại toàn bộ quá trình tách sắc ký của hỗn hợp chất PT  sắc ký đồ gồm nhiều peak.
Đặc điểm của peak PT:
Các peak có thể tách rời nhau hoàn toàn
Chập nhau một phần
Chập nhau hoàn toàn
Sắc ký đồ phản ánh quá trình tách sắc ký trong cột tốt hay không tốt.
Tách tốt: hỗn hợp có bao nhiêu chất  có bấy nhiêu peak riêng biệt không chập nhau
Chất nào bị lưu giữ mạnh sẽ được rửa giải ra sau cùng, chất lưu giữ kém sẽ ra trước
4. Ưu điểm của phương pháp sắc ký
Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất
Không cần làm bay hơi mẫu
- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột
- Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò
- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100L)

Hỗn hợp chất tách khỏi
nhau thế nào ?
Pha tĩnh
Flow
Tại sao lại có sự khác nhau?
Mạnh
Do lực tương tác khác nhau
Yếu
Các cân bằng trong cột HPLC
Mẫu PT đi qua cột: tồn tại đồng thời 3 thành phần:
SP không chuyển động
Chất PT vừa chuyển động từ đầu cột đến cuối cột, đồng thời phân bố lại giữa SP và MP:
Bị SP hấp phụ, rồi rửa giải bởi MP
MP: dung môi rửa giải và chuyển động
Tương tác với các chất, lôi kéo và mang chất PT ra khỏi cột
3 tương tác chính:
Sự tương tác và cân bằng của chất PT với SP
Sự tương tác và cân bằng của chất PT với MP
Sự tương tác của SP và MP
PT
SP
MP
Fa
Fb
Fc
Ftot = Fa + Fb + Fc
Chất nào có lực tương tác lơn nhất sẽ bị giữ lại lâu trên cột
Chất nào có F nhỏ  bị rửa giải đầu tiên
Ftot khác nhau nhiều thì quá trình tách tốt
Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký
column
Vật liệu nhồi cột 3- 5m

column
mixed sample
Quá trình tách
Mobile phase
5. Sắc ký lỏng pha thường và pha đảo
Cột nhồi trong sắc ký pha thường
- Cột silica trung tính:



Bề mặt có chứa nhóm phân cực (ưa nước): -OH
Xác định các chất không phân cực hoặc ít phân cực
Si
Si
Cột silica trên nền mạch carbon:
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
+ Cột cyano: đa mục đích
+ Cột amino: phân tích đường
+ Cột diol: protein
Dung môi chủ yếu: không phân cực
+ Hydrocarbon: hexan, pentan, octan
+ Aromatic hydrocarbon: benzen, toluen, xylen,…
+ Chloroform CHCl3
+ Methylene chloride CH2Cl2
Dung môi phụ: phân cực hoặc hơi phân cực
+ Ethanol, methanol,….
Liên kết hydrogen và thời gian lưu
SiOH
SiOH
Mạnh
Yếu
Rất yếu
Phân cực
1
2
2
1
Rt
Liên kết hydrogen
♣ Mẫu phân tích có:
–COOH: nhóm carboxyl
–OH : nhóm hydroxyl
–NH2 : nhóm amino
♣ Mẫu phân tích có nhóm tert-butyl hoặc các nhóm không phân cực lớn
 LK hydrogen sẽ yếu
Liên kết hydrogen mạnh
Cột nhồi trong sắc ký pha đảo
Cột: không phân cực
Pha động: phân cực
Cột silica đã alkyl hóa các nhóm –OH trên bề mặt silica trung tính:
Cột C18 (ODS)
Cột C8 (octyl)
Cột C4 (butyl)
Cột phenyl
Bề mặt không phân cực
hay ít phân cực
(kỵ nước)
 Xác định chất phân cực, không phân cực và ít phân cực
Thời gian lưu và liên kết kỵ nước
C18 (ODS)
Mạnh
Yếu
1
2
1
2
Dung môi trong HPLC pha đảo
Dung môi phân cực:
Methanol (CH3OH: MEOH), acetonitrile (CH3CN: ACN)
Dung dịch đệm
 Tối ưu hóa tỉ lệ dd đệm/ dung môi rất quan trọng để quá trình tách tốt
So sánh pha thường và pha đảo
Ứng dụng của HPLC
Chủ yếu xác định các hợp chất hữu cơ khó bay hơi trong nhiều đối tượng khác nhau:
+ Amino acid
+ Acid hữu cơ
+ Thuốc trừ sâu
+ ….

Sắc ký ion (Ion Chromatography)
Ion Exchange
N+
R
R
R
Sample
SO3-
Sample
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lực ion
Phân tích các hợp chất ion
Có 2 loại cột:
+ Cột trao đổi cation
Strong cation exchange : (R-SO3-)
Weak cation exchange : (R-COO-)
+ Cột trao đổi anion:
Strong anion exchange : (R4N+)
Weak anion exchange :diethyl aminoethyl)
Pha động: thường là dung dịch đệm trong dung môi nước
Anion:
Carbonat/bicarbonate (Na2CO3/NaHCO3)
Potassium hydroxide (KOH)
Cation:
Nitric acid
Tartaric acid
Tartaric acid/dipicolinic acid
Tartaric acid/citric acid

Ôn tập
Khái niệm về phân tích định lượng
Tính toán và xử lý số liệu phân tích
Phương pháp phân tích dụng cụ
PP phổ hấp thụ phân tử
PP phổ nguyên tử
PP điện hóa
PP sắc ký lỏng
4. Các bài thực tập, tính toán số liệu từ số đo thực nghiệm