Nguyễn Văn Trỗi là con thứ ba (do đó ông còn có tên là Tư Trỗi) trong một gia đình nghèo tại làng Thanh Quýt, xã Điện Thắng, huyện Điện Bàn, Quảng Nam, Việt Nam.
Sau Hiệp ước Genève, gia đình ông vào Sài Gòn sinh sống. Lớn lên, ông làm thợ điện ở nhà máy điện Chợ Quán và tham gia tổ chức Biệt động thành, Đại đội quyết tử cánh Tây Nam Sài Gòn.
Năm 1964, ông được tập huấn cách đánh biệt động nội thành ở căn cứ Rừng Thơm, Đức Hòa (Long An).
Ngày 2 tháng 5 năm 1964, ông nhận nhiệm vụ đặt mìn ở cầu Công Lý (nay là cầu Nguyễn Văn Trỗi), để ám sát phái đoàn quân sự chính trị cao cấp của Chính phủ Hoa Kỳ do Bộ trưởng quốc phòng Robert McNamara dẫn đầu. Công việc bại lộ, ông bị bắt lúc 22 giờ ngày 9 tháng 5 năm 1964.
Chính quyền Việt Nam Cộng hòa đưa ông ra tòa án quân sự kết án tử hình. Để cứu ông, một tổ chức du kích Venezuela tuyên bố trao đổi ông với một con tin là trung tá không quân Hoa Kỳ Michael Smolen mà họ vừa bắt giữ. Tuy nhiên, sau khi viên sĩ quan Hoa Kỳ vừa được trả tự do thì ông bị đưa đi xử bắn.
Nguyễn Văn Trỗi bị xử bắn tại sân sau nhà lao Chí Hòa lúc 9 giờ 45 phút ngày 15 tháng 10 năm 1964, trước sự chứng kiến của nhiều phóng viên nước ngoài. Những phút cuối cùng, ông tỏ ra rất can đảm, không đồng ý bịt mắt và xưng tội và hô lên những lời cuối cùng được các phóng viên ghi lại:
“Hãy nhớ lấy lời tôi!
Đả đảo Đế quốc Mĩ!
Hồ Chí Minh muôn năm!
Việt Nam muôn năm!”
Nguyễn Văn Trỗi
Sau khi chết, Nguyễn Văn Trỗi được truy nhận Đảng viên Nhân dân Cách mạng miền Nam và Mặt trận Dân tộc Giải phóng miền Nam Việt Nam truy tặng Huân chương Thành đồng hạng nhất.
Nguyễn Văn Trỗi lập gia đình với bà Phan Thị Quyên năm 1964. Bà cũng bị bắt sau ông vài ngày nhưng sau đó được thả ra vì không có bằng chứng kết tội. Hai người chưa có con với nhau. Sau khi Nguyễn Văn Trỗi bị xử bắn, bà được các đồng chí của anh đưa ra Bắc học.
